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核酸提取純化的方法有哪些?

更新時(shí)間:2024-03-11      點(diǎn)擊次數(shù):772
核酸提取純化系統(tǒng)是一種用于從樣品中提取純凈核酸的儀器??梢钥焖?、高效地提取純凈的核酸,并且通常具有自動(dòng)化的功能,以減少實(shí)驗(yàn)中的操作步驟和人工誤差。常見的純化方法包括酚氯仿法、鹽析法、玻璃珠法、硅膠膜離心柱法、磁珠法等。


1、苯酚氯仿法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑,反復(fù)抽提,使蛋白質(zhì)變性,SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子,變性降解核蛋白,使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水,卻不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán),也容易進(jìn)行水合作用,并在表面形成一層水化層,使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí),蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞,變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相),DNA存在于上層水相中,蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。利用萃取原理,根據(jù)蛋白核酸溶于不同的試劑層,將槍頭伸入不同液層內(nèi)抽取所需的成分,經(jīng)多次洗滌后獲得純化核酸。

優(yōu)點(diǎn)是采用了實(shí)驗(yàn)室常見的試劑和藥品,做起來成本比較低廉。

缺點(diǎn)是由于使用了苯酚、氯仿等試劑,毒性較大,長(zhǎng)時(shí)間操作對(duì)人員健康有較大影響,而且核酸的回收率較低,損失量較大,由于操作體系大,不同實(shí)驗(yàn)人員操作重復(fù)性差,不利于保護(hù)RNA,很難進(jìn)行微量化的操作。

2、鹽析法
在組織或者細(xì)胞裂解液中加入高濃度鹽(如碘化鈉)來沉淀蛋白質(zhì)等雜質(zhì),從而得到DNA或者RNA。適用于對(duì)核酸純度要求較低的情況。
優(yōu)點(diǎn):成本低,操作簡(jiǎn)單。
缺點(diǎn):產(chǎn)物純度較低
 
3、玻璃珠法
在高鹽條件下,玻璃珠會(huì)自動(dòng)吸附核酸,通過洗滌和離心去除掉蛋白質(zhì)等雜質(zhì);在低鹽條件下,核酸可以從玻璃珠上洗脫下來,二次離心再通過沉淀干燥得到核酸。主要用于凝膠中回收核酸。
優(yōu)點(diǎn)是成本低,操作方便。
缺點(diǎn)是玻璃珠殘留及不易干燥。
 

4、硅膠膜離心柱法
此種方法是利用核酸表面會(huì)覆蓋一層由水分子構(gòu)成的薄膜,在高鹽環(huán)境下,這層親水膜會(huì)遭到破壞從而核酸可被吸附在離心柱上,而其他雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等則會(huì)被離心沉淀與核酸分離。最后通過洗脫,將核酸從吸附膜上脫離,即可得到純化后的核酸。離心柱純化也是的試劑盒提取中廣泛的使用方法。
但即便如此,離心柱純化法仍存在缺點(diǎn):高度依賴吸附膜的結(jié)合能力;洗脫不完全導(dǎo)致核酸流失;無法大量提取核酸

5、磁珠法核酸分離技術(shù)

攜帶正電荷的磁珠易于吸附負(fù)電荷的核酸,主要用于從人血清或血漿樣品中提取DNA 和RNA(例如從血液樣本中檢測(cè)HIV 或HBV 病毒基因組的樣品制備)。一般而言,將樣品與結(jié)合緩沖液和磁珠混合,核酸與磁珠結(jié)合后,經(jīng)過數(shù)次洗滌與磁場(chǎng)捕獲,洗脫下來的核酸即可通過PCR 或其它特定方法來檢測(cè)特定的DNA或RNA。磁分離法也是廣泛應(yīng)用于診斷行業(yè),且能實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的核酸提取方法。

 

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